Линия клеток HepG2 как модель для изучения проникновения статинов в гепатоциты

Статины (ингибиторы β-гидрокси-β-метил-глутарил-КоА редуктазы) - основной класс препаратов для лечения дислипидемий. Для повышения безопасности терапии при их использовании необходима тест-система для оценки их проникновения в гепатоциты с помощью белков-транспортеров ОАТР1В1/ОАТР1В3. Цель исследования разработать метод оценки проникновения статинов внутрь гепатоцитов на клетках линии HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека). Материалы и методы. Клетки культивировали в 6- и 24 луночных планшетах. Наличие ОАТР1В1 в клетках линии HepG2 оценивали с помощью метода вестерн-блот. Проникновение статинов в клетки анализировали на примере аторвастатина. Его добавляли к монослою клеток в концентрациях 1 и 10 мкМ и инкубировали в течение 30 минут. Затем клетки снимали с лунок, лизировали различными способами и определяли количество аторвастатина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Результаты исследования. Методом вестерн-блот было показано наличие ОАТР1В1 в клетках линии HepG2, основного белка, транспортирующего статины внутрь гепатоцитов. Наилучшим способом лизиса клеток оказался трехкратный цикл «заморозка-разморозка» при -80 °C. Аналитический диапазон методики количественного определения аторвастатина в лизате клеток HepG2 методом ВЭЖХ-МС/МС составил 0,5-200 нмоль/л, что позволило выполнять транспортные эксперименты при добавлении аторвастатина в концентрации 1 мкМ и инкубации в течение до 30 мин. Применение ингибитора ОАТР1В1/ ОАТР1В3 - рифампицина (100 мкМ) снижало проникновение аторвастатина внутрь клеток HepG2, что подтверждает адекватность предложенного метода. Выводы. Разработана методика оценки проникновения статинов в гепатоциты на клетках линии HepG2.

аторвастатин, HepG2, белки-транспортеры OATP1B1 /OATP1B3

1. Facciorusso A., Abd El Aziz M. A., Singh S., Pusceddu S., Milione M., Giacomelli L., Sacco R. Statin Use Decreases the Incidence of Hepatocellular Carcinoma: An Updated Meta-Analysis. Cancers (Basel). 2020 Apr 3;12(4):874. doi: 10.3390/cancers12040874.

2. Imprialos, K. P., Stavropoulos, K., Doumas, M., Skalkou A., Zografou, I., & Athyros, V. G. (2018). The potential role of statins in treating liver disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology, 12(4), 331-339. doi: 10.1080/17474124.2018.1439379.

3. Pose E., Trebicka J., Mookerjee R. P., Angeli P., Ginès P. Statins: Old drugs as new therapy for liver diseases? J Hepatol. 2019 Jan;70(1):194-202. doi: 10.1016/j.jhep.2018.07.019.

4. Liao J.K., Laufs U. Pleiotropic effects of statins. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2005;45:89-118. doi: 10.1146/annurev.pharmtox.45.120403.095748.

5. O’Keeffe A.G., Nazareth I., Petersen I. Time trends in the prescription of statins for the primary prevention of cardiovascular disease in the United Kingdom: a cohort study using The Health Improvement Network primary care data. Clin Epidemiol. 2016 May 27; 8:123-32. doi: 10.2147/CLEP.S104258.

6. Sultan S., D’Souza A., Zabetakis I., Lordan R., Tsoupras A., Kavanagh E. P., Hynes N. Statins: Rationale, Mode of Action, and Side Effects. The Impact of Nutrition and Statins on Cardiovascular Diseases. 2019; 171-200. doi: 10.1016/b978-0-12-813792-5.00006-9.

7. Hirota T., Fujita Y., Ieiri I. An updated review of pharmacokinetic drug interactions and pharmacogenetics of statins. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2020 Sep;16(9):809-822. doi: 10.1080/17425255.2020.1801634.

8. Zhang Y., Panfen E., Fancher M., Sinz M., Marathe P., Shen H. Dissecting the Contribution of OATP1B1 to Hepatic Uptake of Statins Using the OATP1B1 Selective Inhibitor Estropipate. Mol Pharm. 2019 Jun 3;16(6):2342-2353. doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b01226.

9. Roth M., Obaidat A., Hagenbuch B. OATPs, OATs and OCTs: the organic anion and cation transporters of the SLCO and SLC22A gene superfamilies. Br J Pharmacol. 2012 Mar;165(5):1260-87. doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01724.x.

10. [Study of the bioequivalence of generic drugs. Guidelines for the examination of medicines]. Moscow. Grif and K. 2013. 328 p. (In Russ.)@@ Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. - М.: Гриф и К; 2013. - 328 с.

11. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). In Vitro Drug Interaction Studies - Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. 2020. 43 P.

12. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry Drug Interaction Studies - Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations. 2012. 75 P.

13. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). Bioanalytical method validation. U. S. Government Printing Office: Washington, DC. 2018, 41 P.

14. ЕМА Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency.Committee for medicinal products for human use: London. 2011, 23 P.

15. [Guidelines for the examination of medicinal products Volume I, rules for conducting bioequivalence studies of medicinal products within the framework of the Eurasian Economic Union, Council of the Eurasian Economic Commission, decision of November 3, 2016 No. 85]. (In Russ).@@ Руководство по экспертизе лекарственных средств Том I, правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза, Совет Евразийской экономической комисси, решение от 3 ноября 2016 № 85.

16. Kunze A., Huwyler J., Camenisch G., Poller B. Prediction of organic anion-transporting polypeptide 1B1- and 1B3-mediated hepatic uptake of statins based on transporter protein expression and activity data. Drug Metab Dispos. 2014 Sep;42(9):1514-21. doi: 10.1124/dmd.114.058412.

17. Vildhede A., Karlgren M., Svedberg E. K., Wisniewski J. R., Lai Y., Norén A., Artursson P. Hepatic uptake of atorvastatin: influence of variability in transporter expression on uptake clearance and drug-drug interactions. Drug Metab Dispos. 2014 Jul;42(7):1210-8. doi: 10.1124/dmd.113.056309.

18. Lau Y.Y., Okochi H., Huang Y., Benet L. Z. Multiple transporters affect the disposition of atorvastatin and its two active hydroxy metabolites: application of in vitro and ex situ systems. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Feb;316(2):762-71. doi: 10.1124/jpet.105.093088.

19. Mandery K., Balk B., Bujok K., Schmidt I., Fromm M. F., Glaeser H. Inhibition of hepatic uptake transporters by flavonoids. Eur J Pharm Sci. 2012 May 12;46(1-2):79-85. doi: 10.1016/j.ejps.2012.02.014.

20. Schlatt L., Costa A. C.C., Barz V., Ciarimboli G., Karst U. Fast simultaneous quantification of gabapentin and cetirizine in cell lysates by means of HPLC-MS/MS. J Pharm Biomed Anal. 2020 May 30;184:113172. doi: 10.1016/j.jpba.2020.113172.

21. Wang S., Ni X. J., Wen Y. G., Xie H. S., Chen J. R., Luo Y. L., Li P. L. A simple and sensitive HPLC-MS/MS assay for the quantitation of montelukast in cell-based systems in vitro pulmonary drug permeability study. J Pharm Biomed Anal. 2021 Jan 5;192:113657. doi: 10.1016/j.jpba.2020.113657.

22. Proctor A., Wang Q., Lawrence D. S., Allbritton N. L. Metabolism of peptide reporters in cell lysates and single cells. Analyst. 2012 Jul 7;137(13):3028-38. doi: 10.1039/c2an16162a.

23. Kindla J., Fromm M. F., König J. In vitro evidence for the role of OATP and OCT uptake transporters in drug-drug interactions. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2009 May;5(5):489-500. doi: 10.1517/17425250902911463.

24. Romaine S.P., Bailey K. M., Hall A. S., Balmforth A. J. The influence of SLCO1B1 (OATP1B1) gene polymorphisms on response to statin therapy. Pharmacogenomics J. 2010 Feb;10(1):1-11. doi: 10.1038/tpj.2009.54.

25. Chung J.Y., Cho J. Y., Yu K. S., Kim J. R., Oh D. S., Jung H. R., Lim K. S., Moon K. H., Shin S. G., Jang I. J. Effect of OATP1B1 (SLCO1B1) variant alleles on the pharmacokinetics of pitavastatin in healthy volunteers. Clin Pharmacol Ther. 2005 Oct;78(4):342-50. doi: 10.1016/j.clpt.2005.07.003.

26. Mori D., Kashihara Y., Yoshikado T., et al. Effect of OATP1B1 genotypes on plasma concentrations of endogenous OATP1B1 substrates and drugs, and their association in healthy volunteers. Drug Metab Pharmacokinet. 2019 Feb;34(1):78-86. doi: 10.1016/j.dmpk.2018.09.003.

27. Molden E., Andersson K. S. Simvastatin-associated rhabdomyolysis after coadministration of macrolide antibiotics in two patients. Pharmacotherapy. 2007 Apr;27(4):603-7. doi: 10.1592/phco.27.4.603.

28. Lea A.P., McTavish D. Atorvastatin. A review of its pharmacology and therapeutic potential in the management of hyperlipidaemias. Drugs. 1997 May;53(5):828-47. doi: 10.2165/00003495-199753050-00011.

29. Schachter M. Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of statins: an update. Fundam Clin Pharmacol. 2005 Feb;19(1):117-25. doi: 10.1111/j.1472-8206.2004.00299.x.

30. Donato M.T., Tolosa L., Gómez-Lechón M. J. Culture and Functional Characterization of Human Hepatoma HepG2 Cells. Methods Mol Biol. 2015;1250:77-93. doi: 10.1007/978-1-4939-2074-7_5.

31. Louisa M., Suyatna F. D., Wanandi S. I., Asih P. B., Syafruddin D. Differential expression of several drug transporter genes in HepG2 and Huh-7 cell lines. Adv Biomed Res. 2016 Jun 8;5:104. doi: 10.4103/2277-9175.183664.

32. Shitara Y. Clinical importance of OATP1B1 and OATP1B3 in drug-drug interactions. Drug Metab Pharmacokinet. 2011 Jun;26(3):220-7. doi: 10.2133/dmpk.DMPK-10-RV-094.

33. Pahwa S., Alam K., Crowe A., Farasyn T., Neuhoff S., Hatley O., Ding K., Yue W. Pretreatment With Rifampicin and Tyrosine Kinase Inhibitor Dasatinib Potentiates the Inhibitory Effects Toward OATP1B1- and OATP1B3-Mediated Transport. J Pharm Sci. 2017 Aug;106(8):2123-2135. doi: 10.1016/j.xphs.2017.03.022.

34. Lau Y. Y., Huang Y., Frassetto L., Benet L. Z. effect of OATP1B transporter inhibition on the pharmacokinetics of atorvastatin in healthy volunteers. Clin Pharmacol Ther. 2007 Feb;81(2):194-204. doi: 10.1038/sj.clpt.6100038.

35. Erokhina PD, Abalenikhina YuV, Shchulkin AV, Chernykh IV, Kotlyarova АА, Pravkin SK, Slepnev AA, Yakusheva EN. Study of influence of estradiol on the activity of P-glycoprotein in vitro. Science of the young (Eruditio Juvenium). 2020;8(3):329-36. (in Russ.) doi:10.23888/HMJ202083329-336.@@ Ерохина П. Д., Абаленихина Ю. В., Щулькин А. В., Черных И. В., Котлярова А. А., Правкин С. К., Слепнев А. А., Якушева Е. Н. Изучение влияния эстрадиола на активность гликопротеина-Р in vitro // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2020. Т. 8, № 3. С. 329-336. doi:10.23888/HMJ202083329-336

36. Erokhina P. D., Abalenikhina Yu.V., Shchulkin A. V., Chernykh I. V., Popova N. M., Slepnev A. A., Yakusheva E. N. A study of influence of progesterone on activity of glycoprotein-P in vitro. I. P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2020;28(2):135-42. (in Russ.) doi:10.23888/PAVLOVJ2020282135-142.@@ Ерохина П. Д., Абаленихина Ю. В., Щулькин А. В., и др. Изучение влияния прогестерона на активность Гликопротеина-P in vitro // Российский медико-биологический вестник им. академика И. П. Павлова. - 2020. - Т. 28. - № 2. - C. 135-142. doi: 10.23888/PAVLOVJ2020282135-142.