Клетки линии Сaco-2 как модель для изучения абсорбции лекарственных веществ

Клетки линии Caco-2 обладают основными свойствами энтероцитов тонкого кишечника, а, следовательно, могут быть использованы для исследования абсорбции лекарственных веществ. Цель. Охарактеризовать и подтвердить свойства линии клеток Caco-2 из Института цитологии РАН и оценить с ее помощью механизм абсорбции оригинального отечественного лекарственного препарата - этилметилгидроксипиридина сукцината (ЭМГПС). Материалы и методы. Исследование выполнено на клетках Сасо-2, которые культивировали в течение 21 сут, так как при этом сроке происходит их спонтанная дифференцировка в поляризованные клетки, подобные энтероцитам тонкого кишечника. Плотность клеточного монослоя оценивали по величине трансэпителиального сопротивления. Количество основных эффлюксных белков транспортеров гликопротеина-Р (Pgp) и белка резистентности рака молочной железы (BCRP) в клетках Caco-2 анализировали с помощью иммуноферментного анализа. В специализированных трансвелл-системах изучали транспорт субстрата Pgp фексофенадина (40, 150 и 300 мкМ), субстрата BCRP - метотрексата (5, 10, 50 мкМ) и ЭМГПС (10, 100 и 250 мкМ) через клеточный монослой. Результаты исследования. К 21 сут культивирования клетки линии Сасо-2 формировали сливающийся монослой с плотными контактами. Количество Pgp и BCRP составило 110,8±14,1 нг/мг и 4,39±0,12 нг/мг соответственно, что соотносится с количеством данных белков в тонком кишечнике человека. Транспорт фексофенадина (40, 150 и 300 мкМ) и метотрексата (5 мкМ) из базолатеральной камеры в апикальную (соответствует транспорту из энтероцитов в просвет кишечника) преобладал над транспортом в противоположном направлении, что связано с функционированием Pgp и BCRP и подтверждает адекватность тест-системы. Транспорт ЭМГПС существенно превосходил по интенсивности транспорт фексофенадина и метотрексата и был симметричен по отношению к клеточному монослою. Заключение. Таким образом, клетки линии Caco-2, коммерчески доступные в Российской Федерации, обладают основными свойствами энтероцитов тонкого кишечника, и могут быть использованы для исследования абсорбции лекарственных веществ in vitro. ЭМГПС быстро проходит через клеточный монослой, а механизмом его абсорбции является пассивная диффузия, без участия специфических транспортеров - Pgp и BCRP.

клетки линии Caco-2, абсорбция, гликопротеин-Р, белок резистентности рака молочной железы, этилметилгидроксипиридина сукцинат

1. Fogh J., Fogh J. M., Orfeo T. One hundred and twenty-seven cultured human tumor cell lines producing tumors in nude mice. J Nat Cancer Inst.1977; 59(1):221-226. doi: 10.1093/jnci/59.1.221.

2. Chantret I., Barbat A., Dusaulx E. et al. Epithelial polarity, vilin expresion, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cels: A survey of twenty cell lines. Cancer Res.1988;48:1936.

3. Sun H., Chow E. C., Liu S., et al. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2008;4(4): 395-411. doi: 10.1517/17425255.4.4.395.

4. Vachon P.H., Beaulieu J. F. Transient mosaic patterns of morphological and functional differentiation in the Caco-2 cell line. Gastroenterology. 1992; 103:414-423. doi: 10.1016/0016-5085(92)90829-n.

5. Watson C.J., Rowland M., Warhurst G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am J Physiol Cell Physiol. 2001;281:388-397. doi: 10.1152/ajpcell.2001.281.2.C388.

6. Thambavita D., Galappatthy P., Mannapperuma U., et al. Biowaiver Monograph for Immediate-Release Solid Oral Dosage Forms: Amoxicillin Trihydrate. J Pharm Sci. 2017;106(10):2930-2945. doi: 10.1016/j.xphs.2017.04.068.

7. Tampal N., Mandula H., Zhang H., et al. Biopharmaceutics classification system-based biowaivers for generic oncology drug products: case studies. AAPS PharmSciTech. 2015;16(1):5-9. doi: 10.1208/s12249-014-0195-7.

8. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). In Vitro Drug Interaction Studies - Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter Mediated Drug Interactions Guidance for Industry, 2020, 43 P.

9. Liu X., Pan G. Drug Transporters in Drug Disposition, Effects and Toxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2019; 1141:580 P.

10. Natoli M., Leoni B. D., D’Agnano I., Zucco F., Felsani A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicol In Vitro. 2012. 26(8):1243-6. doi:10.1016/j.tiv.2012.03.009.

11. Elsby R., Surry D. D., Smith V. N., Gray A. J. Validation and application of Caco-2 assays for the in vitro evaluation of development candidate drugs as substrates or inhibitors of P-glycoprotein to support regulatory submissions. Xenobiotic. 2008;(38):1140-1164. doi:10.1080/00498250802050880.

12. Erokhina P.D., Abalenikhina Yu.V., Shchulkin A. V., Chernykh I. V. et al. A study of influence of progesterone on activity of glycoprotein-P in vitro. I. P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2020;28(2):135-42. (in Russ.) doi:10.23888/PAVLOVJ2020282135-142.@@ Ерохина П. Д., Абаленихина Ю. В., Щулькин А. В., Черных И. В. и др. Изучение влияния прогестерона на активность гликопротеина-Р in vitro. Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. 2020; 28(2): 135-142. doi:10.23888/PAVLOVJ2020282135-142.

13. Chernyh I.V., SHCHul’kin A.V., Gacanoga M. V., Myl’nikov P.YU. [Development of an HPLC method for the quantitative determination of ethylmethylhydroxypyridine succinate in the blood plasma of rats and rabbits]. I. P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2015;23(1):62-66. (In Russ).@@ Черных И. В., Щулькин А. В., Гацанога М. В., Мыльников П. Ю. Разработка ВЭЖХ методики количественного определения этилметилгидроксипиридина сукцината в плазме крови крыс и кроликов. Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. 2015;(23)1:62-66.

14. Mylnikov P. Yu., Tranova Yu., Shchulkin A. V., Yakusheva E. N. Development and validation of the method for the quantitative determination of methotrexate in a transport medium by HPLC-MS/MS. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2021;(1):45-51. (In Russ.) doi:10.37489/2587-7836-2021-1-45-51.@@ Мыльников П. Ю., Транова Ю., Щулькин А. В., Якушева Е. Н. Разработка и валидация методики количественного определения метотрексата в транспортной среде методом ВЭЖХ-МC/МС. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2021;(1):45-51. doi:10.37489/2587-7836-2021-1-45-51.

15. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). Bioanalytical method validation. U. S. Government Printing Office: Washington, DC, 2018, 41 P.

16. Kim K.A., Park J. Y. Effect of metronidazole on the pharmacokinetics of fexofenadine, a P-glycoprotein substrate, in healthy male volunteers. Eur J Clin Pharmacol. 2010; 66(7):721-5. doi: 10.1007/s00228-010-0797-2.

17. Hilgers A.R., Conradi R. A., Burton P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharm Res. 1990;(7):902-910. doi:10.1023/a:1015937605100

18. Fine K.D., Santa Ana C. A., Porter J. L., Fordtran J. S. Effect of changing intestinal flow rate on a measurement of intestinal permeability. Gastroenterology. 1995;108:983-989. doi: 10.1016/0016-5085(95)90193-0.

19. Al-Majdoub Z.M., Achour B., Couto N., Howard M., Elmorsi Y. et al. Mass spectrometry-based abundance atlas of ABC transporters in human liver, gut, kidney, brain and skin. FEBS Lett. 2020;594(23):4134-4150. doi: 10.1002/1873-3468.13982.

20. Maksimovic V., Pavlovic-Popovic Z., Vukmirovic S., Cvejic J. et al. Molecular mechanism of action and pharmacokinetic properties of methotrexate. Mol Biol Rep. 2020;47(6):4699-4708. doi: 10.1007/s11033-020-05481-9

21. Narawa T., Tsuda Ya., Itoh T. Chiral Recognition of Amethopterin Enantiomers by the Reduced Folate Carrier in Caco-2 Cells. Drug Metab. Pharmacokinet. 2007;22(1):33-40. doi: 10.2133/dmpk.22.33.

22. Shchul’kin A.V., CHernyh I.V., Gacanoga M. V., YAkusheva E. N. Vliyanie afobazola na aktivnost’ ABCB1-belka u pacientov s nizkoj trevozhnost’yu. [Effect of afobazole on ABCB1 protein activity in patients with low anxiety]. Pharmacogenetics and Pharmacogenomics. 2019;(2):35-37. (In Russ.) doi: 10.24411/2588-0527-2019-10060.@@ Щулькин А. В., Черных И. В., Гацанога М. В., Якушева Е. Н. Влияние афобазола на активность ABCB1-белка у пациентов с низкой тревожностью. Фармакогенетика и фармакогеномика. 2019;2:35-37. doi: 10.24411/2588-0527-2019-10060. (In Russ.)

23. Shchulkin A.V., Yakusheva E. N., Chernykh I. V. The distribution of mexidol in the rat’s brain and its subcellular fractions. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S. S. Korsakova. 2014;114(8):70-73. (In Russ.)@@ Щулькин А. В., Якушева Е. Н., Черных И. В. Распределение мексидола в структурах головного мозга, его клеточных элементах и субклеточных фракциях. Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. 2014;114(8):70-73.