nogrЭкспериментальная и клиническая гастроэнтерологияExperimental and Clinical Gastroenterology1682-8658«Global Media Technologies»nogr-304Research ArticleЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯEXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGYВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ БАКТЕРИОЦИНОВ У ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Lactobacillus Acidophilus Д № 75 и Lactobacillus Acidophilus Д № 76IDENTIFI CATION OF BACTERIOCIN GENES IN PROBIOTIC STRAINS OF LACTIC ACID BACTERIA Lactobacillus Acidophilus D-75 And Lactobacillus Acidophilus D-76ТороповВ. А.ToropovV. A.noemail@neicon.ruШалаеваО. Н.ShalaevaO. N.noemail@neicon.ruРощинаЕ. К.RoshchinaE. K.noemail@neicon.ruВахитовТ. Я.VakhitovT. Y.tim-vakhitov@yandex.ruСиткинС. И.SitkinS. I.noemail@neicon.ruГос. НИИ ОЧБ ФМБА РоссииРоссияState Research Institute of Highly Pure BiopreparationsRussian FederationГос. НИИ ОЧБ ФМБА России; СЗГМУ им. И. И. МечниковаРоссияState Research Institute of Highly Pure Biopreparations; North-Western State Medical University named after I. I. MechnikovRussian Federation2016201020160105865Copyright © Торопов В.А., Шалаева О.Н., Рощина Е.К., Вахитов Т.Я., Ситкин С.И., 20162016Торопов В.А., Шалаева О.Н., Рощина Е.К., Вахитов Т.Я., Ситкин С.И.Toropov V.A., Shalaeva O.N., Roshchina E.K., Vakhitov T.Y., Sitkin S.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nogr.org/jour/article/view/304

Цель исследования: поиск генов бактериоцинов у пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus Д № 75 и Lactobacillus acidophilus Д № 76, входящих в состав БАД «Витафлор». Материалы и методы: Антагонистическую активность штаммов L. acidophilus Д № 75 и Д № 76 оценивали методом отсроченного антагонизма. Идентификацию генов бактериоцинов проводили методом ПЦР с использованием праймеров, специфичных для генов бактериоцина гельветицина J. Амплифицированные фрагменты секвенировали при помощи секвенатора ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer и анализировали с применением базы данных NCBI/BLASTX. Результаты: Исследуемые бактерии проявляют выраженную антагонистическую активность (АА) против Escherichia coli O75 и Salmonella Enteritidis 209. АА пробиотических штаммов возрастала в 2-2,5 раза в присутствии метабиотика БАД «Актофлор-С», что указывает на ее индуцибельную природу. В ДНК обоих штаммов были выявлены идентичные последовательности размером 537 пар оснований (п. о.), гомологичных фрагменту гена гельветицина штамма L. helveticus DPC4571 (ген lhv_1632). Секвенирование этих фрагментов показало, что они отличаются от референсной ДНК штамма DPC4571 тремя нуклеотидами (А вместо Г в позиции 46, Ц вместо Т в позиции 249 и А вместо Т в позиции 537), причем все эти замены не приводят к изменениям соответствующей аминокислотной последовательности бактериоцина. Кроме фрагмента 537 п. о. у штамма L. acidophilus Д № 76 был выявлен другой фрагмент гена бактериоцина величиной 283 п. о., имевший 95% гомологии с геном гельветицина J штамма L. helveticus R0052 (ген R0052_09025). В базе данных NCBI/BLASTX еще у 11 микроорганизмов, относящихся к L. acidophilus, L. amylovorus, L. crispatus, L. gallinarum, L. helveticus и L. kitasatonis, были обнаружены последовательности, гомологичные гену гельветицина штамма L. helveticus DPC4571. Заключение: Полученные данные свидетельствуют о существовании, по крайней мере, двух бактериоцинов у L. acidophilus Д № 76 и одного - у L. acidophilus Д № 75. Однако истинный потенциал бактериоцинов этих пробиотических штаммов для здоровья человека еще только предстоит раскрыть.

Aim: to detect the bacteriocin genes of probiotic strains Lactobacillus acidophilus D-75 and Lactobacillus acidophilus D-76 (components of Vitaflor dietary supplement). Materials and Methods: The antagonistic activity of L. acidophilus D-75 and L. acidophilus D-76 strains was estimated by the deferred antagonism method. The identification of bacteriocin genes was performed by PCR using helveticin J gene primers. Amplified fragments were sequenced using ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer and were analyzed using NCBI/BLASTX. Results: The test bacteria exhibit pronounced antagonistic activity (AA) against Escherichia coli O75 and Salmonella Enteritidis 209. In the presence of Actoflor-S (metabiotic dietary supplement) the antagonistic activity of tested probiotic strains was 2-2.5-fold increased indicating its inducible nature. The identical sequences of 537 bp homologous to gene fragment of helveticin of L. helveticus DPC4571 (lhv_1632 gene) were detected in DNA of both strains. Sequencing of these fragments showed difference in three nucleotides compared to the reference DNA of DPC4571 strain (A instead of G at position 46, C instead of T at position 249 and A instead of T at position 537), but all these replacements do not lead to changes in the amino acid sequence of a bacteriocin. For L. acidophilus D-76 another bacteriocin gene fragment of 283 bp was identified (in addition to 537 bp fragment). The latter had 95% homology with the helveticin J gene of L. helveticus R0052 (R0052_09025 gene). In NCBI/BLASTX database the sequences homologous to the helveticin gene of L. helveticus DPC4571 were found in 11 microorganisms related to L. acidophilus, L. amylovorus, L. crispatus, L. gallinarum, L. helveticus and L. kitasatonis. Conclusion: Thus, our study shows that there are at least two bacteriocins in L. acidophilus D-76 and one bacteriocin in L. acidophilus D-75. However, the true potential of these probiotic bacteriocins for human health has yet to be realized.

Актофлор-Сантагонистическая активностьВитафлоргельветицингены бактериоциновлактобациллыпробиотикисеквенированиеActoflor-Santagonistic activitybacteriocin genehelveticinLactobacillusprobioticssequencingVitaflorReferencesWeirich A, Hoffmann GF. Ernst Moro (1874-1951) - a great pediatric career started at the rise of university-based pediatric research but was curtailed in the shadows of Nazi laws. Eur J Pediatr. 2005 Oct;164(10):599-606. doi: 10.1007/s00431-005-1703-2.Weirich A, Hoffmann GF. Ernst Moro (1874-1951) - a great pediatric career started at the rise of university-based pediatric research but was curtailed in the shadows of Nazi laws. Eur J Pediatr. 2005 Oct;164(10):599-606. doi: 10.1007/s00431-005-1703-2.Петров Л. Н., Вербицкая Н. Б., Добрица В. П., Галкин Г. Н., Петров Н. Л. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. - СПб.: ФГУП Гос. НИИ ОЧБ, 2008. - 136 с.Петров Л. Н., Вербицкая Н. Б., Добрица В. П., Галкин Г. Н., Петров Н. Л. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. - СПб.: ФГУП Гос. НИИ ОЧБ, 2008. - 136 с.Riley MA, Wertz JE. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annu Rev Microbiol. 2002;56:117-37. doi: 10.1146/annurev.micro.56.012302.161024.Riley MA, Wertz JE. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annu Rev Microbiol. 2002;56:117-37. doi: 10.1146/annurev.micro.56.012302.161024.Cui Y, Zhang C, Wang Y, Shi J, Zhang L, Ding Z, Qu X, Cui H. Class IIa bacteriocins: diversity and new developments. Int J Mol Sci. 2012 Dec 6;13(12):16668-707. doi: 10.3390/ijms131216668.Cui Y, Zhang C, Wang Y, Shi J, Zhang L, Ding Z, Qu X, Cui H. Class IIa bacteriocins: diversity and new developments. Int J Mol Sci. 2012 Dec 6;13(12):16668-707. doi: 10.3390/ijms131216668.Garneau S, Martin NI, Vederas JC. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Biochimie. 2002 May-Jun;84(5-6):577-92.Garneau S, Martin NI, Vederas JC. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Biochimie. 2002 May-Jun;84(5-6):577-92.Annuk H, Shchepetova J, Kullisaar T, Songisepp E, Zilmer M, Mikelsaar M. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates. J Appl Microbiol. 2003;94(3):403-12.Annuk H, Shchepetova J, Kullisaar T, Songisepp E, Zilmer M, Mikelsaar M. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates. J Appl Microbiol. 2003;94(3):403-12.Joerger MC, Klaenhammer TR. Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481. J Bacteriol. 1986 Aug;167(2):439-46.Joerger MC, Klaenhammer TR. Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481. J Bacteriol. 1986 Aug;167(2):439-46.Drider D, Fimland G, Héchard Y, McMullen LM, Prévost H. The continuing story of class IIa bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev. 2006 Jun;70(2):564-82. doi: 10.1128/MMBR.00016-05.Drider D, Fimland G, Héchard Y, McMullen LM, Prévost H. The continuing story of class IIa bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev. 2006 Jun;70(2):564-82. doi: 10.1128/MMBR.00016-05.Вахитов Т. Я., Вербицкая Н. Б., Добролеж О. В., Полевая Е. В., Кобатов А. И. Влияние метаболитов пробиотических и патогенных бактерий на антагонистическую активность Lactobacillus acidophilus Д № 75 / Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ). - 2013. - № 92 (08) - С. 312-327. - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2013/08/pdf/22.pdfВахитов Т. Я., Вербицкая Н. Б., Добролеж О. В., Полевая Е. В., Кобатов А. И. Влияние метаболитов пробиотических и патогенных бактерий на антагонистическую активность Lactobacillus acidophilus Д № 75 / Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ). - 2013. - № 92 (08) - С. 312-327. - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2013/08/pdf/22.pdfPranckutė R, Kaunietis A, Kuisienė N, Čitavičius DJ. Combining prebiotics with probiotic bacteria can enhance bacterial growth and secretion of bacteriocins. Int J Biol Macromol. 2016 Aug;89:669-76. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2016.05.041.Pranckutė R, Kaunietis A, Kuisienė N, Čitavičius DJ. Combining prebiotics with probiotic bacteria can enhance bacterial growth and secretion of bacteriocins. Int J Biol Macromol. 2016 Aug;89:669-76. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2016.05.041.Dobson A, Cotter PD, Ross RP, Hill C. Bacteriocin production: a probiotic trait? Appl Environ Microbiol. 2012 Jan;78(1):1-6. doi: 10.1128/AEM.05576-11.Dobson A, Cotter PD, Ross RP, Hill C. Bacteriocin production: a probiotic trait? Appl Environ Microbiol. 2012 Jan;78(1):1-6. doi: 10.1128/AEM.05576-11.Fernandez B, Le Lay C, Jean J, Fliss I. Growth, acid production and bacteriocin production by probiotic candidates under simulated colonic conditions. J Appl Microbiol. 2013 Mar;114(3):877-85. doi: 10.1111/jam.12081.Fernandez B, Le Lay C, Jean J, Fliss I. Growth, acid production and bacteriocin production by probiotic candidates under simulated colonic conditions. J Appl Microbiol. 2013 Mar;114(3):877-85. doi: 10.1111/jam.12081.van Soolingen D, Hermans PW, de Haas PE, Soll DR, van Embden JD. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 1991 Nov;29(11):2578-86.van Soolingen D, Hermans PW, de Haas PE, Soll DR, van Embden JD. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 1991 Nov;29(11):2578-86.Foster LM, Tompkins TA, Dahl WJ. A comprehensive post-market review of studies on a probiotic product containing Lactobacillus helveticus R0052 and Lactobacillus rhamnosus R0011. Benef Microbes. 2011 Dec 1;2(4):319-34. doi: 10.3920/BM2011.0032.Foster LM, Tompkins TA, Dahl WJ. A comprehensive post-market review of studies on a probiotic product containing Lactobacillus helveticus R0052 and Lactobacillus rhamnosus R0011. Benef Microbes. 2011 Dec 1;2(4):319-34. doi: 10.3920/BM2011.0032.Drider D, Bendali F, Naghmouchi K, Chikindas ML. Bacteriocins: Not Only Antibacterial Agents. Probiotics Antimicrob Proteins. 2016 Aug 1. doi: 10.1007/s12602-016-9223-0.Drider D, Bendali F, Naghmouchi K, Chikindas ML. Bacteriocins: Not Only Antibacterial Agents. Probiotics Antimicrob Proteins. 2016 Aug 1. doi: 10.1007/s12602-016-9223-0.Hegarty JW, Guinane CM, Ross RP, Hill C, Cotter PD. Bacteriocin production: a relatively unharnessed probiotic trait? F1000Res. 2016 Oct 27;5:2587. eCollection 2016. doi: 10.12688/f1000research.9615.1.Hegarty JW, Guinane CM, Ross RP, Hill C, Cotter PD. Bacteriocin production: a relatively unharnessed probiotic trait? F1000Res. 2016 Oct 27;5:2587. eCollection 2016. doi: 10.12688/f1000research.9615.1.Ситкин С. И., Ткаченко Е. И., Вахитов Т. Я. Филометаболическое ядро микробиоты кишечника // Альманах клинической медицины. - 2015. - № 40. - С. 12-34. doi: 10.18786/2072-0505-2015-40-12-34.Ситкин С. И., Ткаченко Е. И., Вахитов Т. Я. Филометаболическое ядро микробиоты кишечника // Альманах клинической медицины. - 2015. - № 40. - С. 12-34. doi: 10.18786/2072-0505-2015-40-12-34.Shenderov BA. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microb Ecol Health Dis. 2013 Apr 12;24. doi: 10.3402/mehd.v24i0.20399.Shenderov BA. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microb Ecol Health Dis. 2013 Apr 12;24. doi: 10.3402/mehd.v24i0.20399.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.